Меню Рубрики

Определение содержания фибриногена в плазме крови по методу рутберг

Фибриноген – гликопротеид, растворимый предшественник нерастворимого фибрина.

Фибриноген синтезируется печенью в количестве 2-5 г в день, время его полувыведения из крови около 4-х дней.

Фибриноген относится к острофазным белкам, увеличивающийся в острой фазе воспаления. Повышение уровня фибриногена в острой фазе, как правило, имеет транзиторный характер в отличие от атеросклероза, при котором наблюдается устойчивое увеличение этого показателя, трудно поддающегося корреляции лекарственными препаратами.

Поскольку фибриногену принадлежит важная роль в системе свертывания крови, повышение его уровня при атеросклерозе принято рассматривать как один из патогенетических механизмов, обусловливающих повышенную свертываемость крови и нарушение регуляции тромбообразования, которое, в свою очередь, приводит к развитию инфаркта миокарда или инсульта.

Определение фибриногена в плазме крови часто используют не только при диагностике нарушений гемостаза, но и при распознавании и оценке тяжести воспалительных, иммунных и опухолевых процессах.

Гиперфибириногенемия – повышение уровня фибриногена в крови.

Является фактором повышенного риска развития артериальных тромбозов и инфарктов органов.

Физиологическое: беременность, менструация.

· Реакции острой фазы (лихорадка, инфекционные болезни, воспалительные и некротические процессы; травмы, ожоги, хирургические операции).

· Злокачественные опухоли (рак легкого)

· Болезни почек (острый и хронический пиелонефрит, гломерулонефрит; нефротический синдром)

Гипофибириногенемия – снижение концентрации уровня фибриногена в крови.

· Наследственный дефицит фибриногена (а- и гипофибриногенемия)

· ДВС-синдром (синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания)

· Состояние после кровотечения, травмы, ожога.

· Болезни печени (острая желтая атрофия печени, цирроз)

· Отравление гепатотропными ядами.

· Заболевания, сопровождающиеся поражением костного мозга (лейкозы)

· Лекарственные препараты (фенобарбитал)

Уменьшение содержание фибриногена плазмы до уровня ниже 1 г/л служит фактором риска появления кровотечений из сосудов внутренних органов.

Определение содержания фибриногена весовым (гравиметрическим) методом по Рутберг Р.А.

Принцип. Образовавшийся после свертывания плазмы крови фибрин быстро высушивается, и по весу определяют содержание фибриногена в плазме.

1. Хлорид кальция, 5% раствор;

2. Эмульсия тканевого тромбопластина на трис-буфере, 0,05 М (или буфере Михаэлиса), рН 7,3-7,4, для чего навеску сухого тромбопластина (50мг) тщательно растирают в 1,0 мл буфера. Постепенно объем смеси увеличивают добавлением буфера до 5,0 мл. Полученную эмульсию центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин, надосадочную жидкость отделяют и используют для анализа.. Эмульсия тромбопластина хранится при +2….+8 ° С в течение 3 суток.

Активность тромбопластина может быть в пределах 11 – 20 сек.

Материал для исследования: цитратная плазма.

К 1,0 мл плазмы в пробирке последовательно добавляют 0,1 мл эмульсии тромбопластина (или раствор тромбина) и 0,1 мл 5% р-ра хлорида кальция. Реагенты перемешивают стеклянной палочкой. Палочку оставляют в пробирке. Смесь инкубируют в термостате с прозрачными стенками (ТПС) или на водяной бане (37 ° С) 10 — 20 мин, после чего образовавшийся сгусток переносят на фильтровальную бумагу и высушивают путем сжатия и перемещения сгустка по бумаге. Такое высушивание продолжают до тех пор, пока на фильтре не перестанут определяться следы влаги в проходящем свете. Сгусток фибрина взвешивают на торсионных весах.

В норме масса сгустка фибрина составляет 9 – 18 мг.

Расчет : для определения концентрации фибриногена, выраженной в г/л, массу фибрина в мг умножают на коэффициент 0,222.

Фибриноген в г/л = мг фибрина ´ 0,222

источник

Содержания фибриногена в плазме крови. Фибриноген – это предшественник фибрина, основного компонента кровяного сгустка. Представляет собой бесцветный белок, растворенный в плазме крови.

Фибриноген образуется в печени, время его жизни — около 4 суток (100 часов). Это гликопротеин с молекулярной массой 330 000-340 000 Да.

В организме человека фибриноген выполняет две основные задачи:

1. Участвует в процессе свёртывания крови в роли фактора свертывания I.

2. Участвует в воспалительных реакциях как белок острой фазы воспаления.

При активации процесса свертывания крови фибриноген под действием тромбина преобразуется в фибрин. Сначала от фибриногена отщепляются фибронопептиды А и В, которые являются основой фибрин-мономера. Затем в ходе реакции полимеризации фибринопептиды преобразуются в растворимый фибрин. Для перехода полученного фибрина в нерастворимую форму необходимы иона кальция, тромбин и фактор свертывания XIII. Нерастворимый фибрин образует тромб, который завершает процесс свёртывания крови.

В качестве белка острой фазы фибриноген участвует в воспалительных реакциях, он быстро реагирует на появление очага воспаления или некроза в тканях. Он влияет на скорость оседания эритроцитов (СОЭ) таким образом, что при повышении уровня фибриногена в крови СОЭ увеличивается.

Физиологическое повышение уровня фибриногена в крови отмечается при беременности, особенно в третьем триместре.

Скрининговая оценка состояния системы свёртывания крови.

Подготовка к оперативному вмешательству.

Заболевания сердечно-сосудистой системы.

Кровь на исследование сдают утром натощак, исключается даже чай или кофе. Допустимо пить обычную воду.

Временной интервал от последнего приёма пищи до сдачи анализа – не менее восьми часов.

Исключить физическую активность за 30 минут до забора крови.

Норма: 2,0 — 4,0 г/л.

Минимум, необходимый для гемостаза — 0,5 г/л.

1. Воспалительные процессы во внутренних органах:

  • в лёгких – пневмонии,
  • в почках – пиелонефрит острый и хронический, гломерулонефрит, нефротический синдром,
  • в брюшине – перитонит.

2. Реакции острой фазы заболеваний – лихорадка, острый инфаркт миокарда, ожоги, травматические повреждения, состояние после обширных хирургических вмешательств.

3. Диффузные заболевания соединительной ткани – склеродермия, узелковый периартериит, ревматоидный артрит, системная красная волчанка.

5. Некоторые злокачественные опухоли – рак лёгких.

6. Физиологическое повышение при беременности и менструации.

1. Наследственный дефицит фибриногена (афибриногенемия и гипофибриногенемия).

3. Состояние после острого кровотечения.

4. Отслойка плаценты при беременности.

6. Менингококковый менингит.

7. Рак простаты с метастазами в других органах.

8. Заболевания, сопровождающиеся поражением костного мозга – метастазы опухолей в костный мозг.

10. Острая и хроническая печеночная недостаточность.

11. Болезни печени при развитии печеночно-клеточной недостаточности – цирроз печени, отравление гепатотропными ядами.

12. Приём лекарственных препаратов (фенобарбитал, стрептокиназа, урокиназа).

Выберите беспокоящие вас симптомы, ответьте на вопросы. Выясните, насколько серьезна ваша проблема и нужно ли обращаться к врачу.

Перед использованием информации, предоставляемой сайтом medportal.org, пожалуйста, ознакомьтесь с условиями пользовательского соглашения.

Сайт medportal.org предоставляет услуги на условиях, описанных в настоящем документе. Начиная пользоваться веб-сайтом Вы подтверждаете, что ознакомились с условиями настоящего Пользовательского соглашения до начала пользования сайтом, и принимаете все условия данного Соглашения в полном объеме. Пожалуйста, не пользуйтесь веб-сайтом, если Вы не согласны с данными условиями.

Описание услуги

Вся информация, размещённая на сайте, носит справочный характер, информация взята из открытых источников является справочной и не является рекламой. Сайт medportal.org предоставляет услуги, позволяющие Пользователю производить поиск лекарственных средств в данных, полученных от аптек в рамках соглашения между аптеками и сайтом medportal.org. Для удобства пользования сайтом данные по лекарственным средствам, БАД систематизируются и приводятся к единому написанию.

Сайт medportal.org предоставляет услуги, позволяющие Пользователю производить поиск клиник и другой информации медицинского характера.

Ограничение ответственности

Размещенная в результатах поиска информация не является публичной офертой. Администрация сайта medportal.org не гарантирует точность, полноту и (или) актуальность отображаемых данных. Администрация сайта medportal.org не несет ответственности за вред или ущерб, который Вы могли понести от доступа или невозможности доступа к сайту или от использования или невозможности использования данного сайта.

Принимая условия настоящего соглашения, Вы полностью понимаете и соглашаетесь с тем, что:

Информация на сайте носит справочный характер.

Администрация сайта medportal.org не гарантирует отсутствия ошибок и расхождений относительно заявленного на сайте и фактического наличия товара и цен на товар в аптеке.

Пользователь обязуется уточнить интересующую его информацию телефонным звонком в аптеку или использовать предоставленную информацию по своему усмотрению.

Администрация сайта medportal.org не гарантирует отсутствия ошибок и расхождений относительно графика работы клиник, их контактных данных – номеров телефонов и адресов.

Ни Администрация сайта medportal.org, ни какая-либо другая сторона, вовлеченная в процесс предоставления информации, не несет ответственности за вред или ущерб, который Вы могли понести от того, что полностью положились на информацию, изложенную на этом веб-сайте.

Администрация сайта medportal.org предпринимает и обязуется предпринимать в дальнейшем все усилия для минимизации расхождений и ошибок в предоставленной информации.

Администрация сайта medportal.org не гарантирует отсутствия технических сбоев, в том числе в отношении работы программного обеспечения. Администрация сайта medportal.org обязуется в максимально короткие сроки предпринять все усилия для устранения каких-либо сбоев и ошибок в случае их возникновения.

Пользователь предупрежден о том, что Администрация сайта medportal.org не несет ответственности за посещение и использование им внешних ресурсов, ссылки на которые могут содержаться на сайте, не предоставляет одобрения их содержимого и не несет ответственности за их доступность.

Администрация сайта medportal.org оставляет за собой право приостановить действие сайта, частично или полностью изменить его содержание, внести изменения в Пользовательское соглашение. Подобные изменения осуществляются только на усмотрение Администрации без предварительного уведомления Пользователя.

Вы подтверждаете, что ознакомились с условиями настоящего Пользовательского соглашения , и принимаете все условия данного Соглашения в полном объеме.

Рекламная информация, на размещение которой на сайте имеется соответствующее соглашение с рекламодателем, имеет пометку «на правах рекламы».

источник

Определение концентрации фибриногена в клинической практике проводят для оценки системы гемостаза, острофазного ответа и риска развития сердечно-сосудистых заболеваний. Референтный диапазон его концентрации составляет 2,0-4,0 г/л и практически не зависит от пола и возраста, а при тяжелых бактериальных инфекциях, травмах его концентрация может превышать 10 г/л.

Для количественного определения концентрации фибриногена в условиях клинико-диагностических лабораторий наиболее применим метод Клаусса в основе которого лежит логарифмическая зависимость концентрации фибриногена в разведенной исследуемой плазме от lg времени образования сгустка после добавления к плазме тромбина высокой активности.

Перед регистрацией времени образования фибринового сгустка исследуемую плазму первоначально разводят буферным раствором в 10 раз, поскольку только в условиях высокой активности тромбина и низких концентраций фибриногена наблюдается линейная зависимость концентрации от времени образования фибрина. Такое разведение плазмы крови позволяет определять концентрацию фибриногена ориентировочно в диапазоне до 5,0 г/л. Этап разведения образца плазмы может отрицательно влиять на воспроизводимость метода.

Исключение этапа предварительного разведения пробы представляется целесообразным с позиции контроля качества исследований, и реализовано в модифицированном методе Клаусса используемого новой тест-системой «МультиТех-Фибриноген» производства фирмы « Технология –Стандарт». Модифицированный метод Клаусса позволяет исследовать концентрацию фибриногена в более широком диапазоне и исключить влияние этапа разведения пробы на правильность и воспроизводимость.

Метод может быть применен для определения концентрации фибриногена на коагулометрах с оптическим, оптико-механическим и механическим принципом регистрации образования сгустка.

Ниже приводятся результаты апробации и сравнения новой тест-системы с наборами реагентов для определения концентрации фибриногена других производителей.

Принцип метода заключается в определении времени свертывания цитратной плазмы избытком тромбина. Концентрация фибриногена определяется по калибровочной кривой, построенной в билогарифмической системе координат.

Подготовка реагентов к работе и проведение исследования приведены в инструкции к набору реагентов «МультиТех-Фибриноген».

Оценка результатов: Время свертывания исследуемого образца плазмы составляет 5-100 с, в зависимости от концентрации фибриногена и типа коагулометра. Диапазон определения концентрации фибриногена без дополнительного разведения составляет 0,9-10,0 г/л. Если результаты определения близки к 0,9 г/л или меньше (отсутствие регистрации сгустка), концентрацию фибриногена следует определить классическим методом Clauss набором реагентов «Тех-фибриноген-тест» (кат. № 094 или кат. № 324) или аналогичным с разведением плазмы 1:5. Концентрация фибриногена у здоровых людей находится в диапазоне от 2,0 до 4,0 г/л.

Результаты сравнительного тестирования набора реагентов «МультиТех-Фибриноген» с близкими по назначению наборами и различных коагулометрах

Калибровка тест-системы «МультиТех-Фибриноген» выполнена на коагулометрах с разным принципом регистрации времени образования сгустка с использованием набора «МультиТех-Калибратор», состоящего из 5 лиофилизированных образцов калибровочных плазм с концентрацией фибриногена 1.25, 2.2, 3.2, 5.5, 8.0 г/л. Калибровочные кривые, построенные для разных приборов, представлены на рис. Зависимость концентрации фибриногена от времени образования сгустка в билогарифмической системе координат приближается к прямой линии на всей области тестирования.

Рис. Калибровочные кривые, полученные при использовании набора «МультиТех-Фибриноген» на разных коагулометрах

Сравнение разных тест-систем проведено с использованием контрольной плазмы с концентрациями фибриногена 0,6; 1, 1; 2,3; 3,4; 5,6; 8,4 г/л . В таблице 1 приведены данные по стабильности определения КФ в плазме крови наборами реагентов разных фирм при проведении исследования по методу Клаусса с предварительным разведением плазмы 1:10, и использовании цельной плазмы, при проведении исследования по модифицированному методу.

ВАЖНО! Применение модифицированного метода Клаусса позволяет расширить диапазон уверенного определения КФ для разных типов коагулометров, особенно в области высоких концентраций, требующих дополнительного разведения пробы при классическом варианте метода.

Таблица 1.
Результаты определения КФ тест-системами разных производителей

источник

1 Определение концентрации фибриногена в клинико-диагностической лаборатории Бирюля Диана Геннадьевна ООО фирма «Технология-Стандарт»

2 Фибриноген гликопротеин плазмы крови синтезируется в печени в количестве 2-5 г в день, время его полувыведения около 4-х дней Функции: образование фибринового сгустка, заживление ран, фибринолиз, воспаление, ангиогенез, клеточное и структурное взаимодействие, неоплазия Референтные значения 2,0-4,0 г /л концентрация может увеличиться на % во время физиологического стресса

3 сложный гликопротеин, состоящий из трех пар полипептидов:α,β и ϒ полипептиды связаны друг с другом 29 дисульфидными связями

4 Клинико-диагностическое значение Гиперфибриногенемия повышение уровня фибриногена в крови. Является фактором повышенного риска развития артериальных тромбозов и инфарктов органов. Физиологическое: холодное время года, беременность, менструация, постменопауза Патологическое повышение: Реакции острой фазы (лихорадка, инфекционные болезни, воспалительные и некротические процессы; травмы, ожоги, хирургические операции). Злокачественные опухоли, метастазирование Курение Оральные контрацептивы

5 Клинико-диагностическое значение Гипофибриногенемия снижение концентрации уровня фибриногена в крови. Наследственный дефицит фибриногена (а- и дисфибриногенемия) ДВС-синдром (синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания) Гемодилюция кровезаменителями Декомпенсированные болезни печени (вирусные гепатиты, цирроз) Уменьшение содержание фибриногена плазмы до уровня ниже 1 г/л служит фактором риска появления кровотечений из сосудов внутренних органов

6 Историческая справка R. Wirchow в 1847 году предположил, что существует некий растворимый предшественник в плазме, из которого и формируется кровяной сгусток в 1859 году Deni de Commercy впервые предложил для этого предшественника термин «фибриноген» в 1876 году выделен Олафом Хаммарстен (Швеция) из плазмы лошадей В 1904 году А. Шмидт наряду с тромбином определил центральную роль F I в коагуляционном каскаде В 1909 году, фибриноген впервые был выделен в хорошо очищенном виде

7 Методы определения концентрации фибриногена в крови Нефункциональные методы: высаливания или тепловой преципитации фибриногена с последующим количественным исследованием коагулята (объемным методом, фотометрией) образование стабильного фибрина с последующим выделением и взвешиванием фотометрическое определение после растворения фибрина при помощи биуретового реактива иммунологический метод Функциональные методы определение по Клауссу с тромбином турбидиметрическая модификация c батроксобином

8 Данный этап практически невозможно сделать стандартным. Сильное отжимание сгустка — приводит к потерям фибрина Слабое отжимание — к ложному завышению уровня фибриногена Определение содержания весовым (гравиметрическим) методом по Рутберг Р.А. Принцип. Образовавшийся после свертывания плазмы крови фибрин быстро высушивается, и по весу определяют содержание фибриногена в плазме. Реактивы:1. Хлорид кальция, 5% раствор; 2. Эмульсия тканевого тромбопластина на трис-буфере, 0,05 М (или буфере Михаэлиса), рн 7,3-7,4 Материал для исследования: цитратная плазма. Ход определения: К 1,0 мл плазмы в пробирке последовательно добавляют 0,1 мл эмульсии тромбопластина (или раствор тромбина) и 0,1 мл 5% р-ра хлорида кальция. Реагенты перемешивают стеклянной палочкой. Палочку оставляют в пробирке. Смесь инкубируют в термостате с прозрачными стенками (ТПС) или на водяной бане (37 С) мин, после чего образовавшийся сгусток переносят на фильтровальную бумагу и высушивают путем сжатия и перемещения сгустка по бумаге. Сгусток фибрина взвешивают на торсионных весах. В норме масса сгустка фибрина составляет 9 18 мг. Расчет: для определения концентрации фибриногена, выраженной в г/л, массу фибрина в мг умножают на коэффициент 0,222. Фибриноген в г/л = мг фибрина 0,222 Норма в плазме: 2 4 г/л Сгусток может быть рыхлым вследствие наличия ингибиторов тромбообразования Большой объем используемой плазмы ограничивает использование в педиатрии Экономичен Данный этап практически невозможно стандартизировать! Сильное отжимание — приводит к потерям фибрина Слабое отжимание — к ложному завышению уровня фибриногена Максимальный контакт персонала с кровью

9 Иммунологические методы определения концентрации фибриногена и электрофрез иммуноферментный анализ (ELISA) радиальная иммунодиффузия иммунонефелометрии электрофорез Измерение концентрации белка, а не его функциональной активности Занимает много времени Ложные результаты при наличии ПДФ Использование моноклональных антител к разным антигенам фибриногена позволяет выявлять функциональные формы Рекомендован к использованию для оценки риска кардиоваскулярных заболеваний Fibrinogen antigen measurement is suitable for studies assessing fibrinogen as a risk factor for cardiovascular disease (Cremer et al, 1994; Sweetnam et al, 1996, 1998)

10 Определение концентрации фибриногена в протромбиновом тесте (PT derived Fibrinogen) Анализатор калибруется при исследовании протромбинового время плазмы (или серии разведений плазмы) с известной концентрацией фибриногена и построения графиков изменения оптической плотности по отношению к концентрации фибриногена в логарифмических шкалах Применение PT-Fg метода обеспечивает быстрое измерение фибриногена без каких-либо дополнительных затрат Метод применим только на автоматических анализаторах Результаты зависят от метода калибровки, типа анализатора и реагентов, и оптической прозрачности пробы Не рекомендован к применению у больных с ДВС, заболевания печени, заболевания почек, дисфибриногенемией, с высоким или низким уровнем фибриногена получавших антикоагулянты, тромболитической терапией Guidelines on fibrinogen assays British Journal of Haematology, 2003, 121, Корреляция с методом Clauss нелинейная (сигмовидная)

11 Метод Сlauss Clauss, A. (1957) Gerinnungsphysiologische schnellmethode zur bestimmung des fibrinogens. Acta Haematologica, 17, К плазме крови добавляют тромбин высокой активности и измеряют время образования сгустка. Расчет концентрации фибриногена проводят по калибровочной кривой построенной в логарифмических шкалах. Для исследования используют плазму крови разведенную буфером в 10 раз. Диапазон значений при стандартном разведении плазмы от 1 до 5 г/л Выполняется на коагулометрах с механическим и оптическим типом детекции образования сгустка Метод рекомендован для разных групп пациентов Построение калибровочных кривых позволяет адаптировать любой прибор к набору реагентов Дополнительные разведения образца необходимы если превышен диапазон линейности Малочувствителен к гепарину в терапевтических дозах и ПДФ Исследование может быть выполнено на коагулометре с любым вариантом регистрации образования сгустка

Читайте также:  Ачтв и фибриноген низкий

12 Классический метод Clauss ПЛАЗМА КРОВИ + БУФЕР ПЛАЗМА разведение 1:9 этап предварительного разведения плазмы ТРОМБИН Диапазон линейности метода от 1 до 5 г/л фибриногена Время образования сгустка от 4 сек иследование только на коагулометре

13 Модифицированный метод Clauss Нет этапа предварительного разведения плазмы ПЛАЗМА ТРОМБИН Диапазон линейности метода от 1 до 10 г/л фибриногена

14 Наборы реагентов модифицированного метода CLAUSS в России Барнаул

15 Калибровка 100 Время, сек 10 STart-4 CoaData KC 4D АПГ Концентрация фибриногена, г/л

источник

Синонимы: Фибриноген, Fibrinogen.

Фибриноген или фактор I (первый) является компонентом коагулограммы, который демонстрирует свертывающую способность крови. После синтеза в печени фибриноген выбрасывается в кровоток вместе с аналогичными веществами, обеспечивая гемостаз всего организма. Благодаря фибриногену образуется тромб – кровяной сгусток, который закупоривает открытую рану, замедляя и останавливая кровотечение.

Анализ на фибриноген входит в программу пренатальной (дородовой) диагностики, назначается в процессе обследования сердечно-сосудистых, воспалительных и инфекционных заболеваний, а также в предоперационной подготовке больного.

Печень производит белок фибриноген, который трансформируется в нерастворимый фибрин. Именно он составляет базу для кровяного сгустка в процессе свертывания. Сгусток, в свою очередь, уплотняется и образует тромб – корочку, которая образуется на поверхности раны. Этот этап считается завершением процесса свертывания.

Уровень фибриногена в крови зависит от здоровья и функционирования печени. Также для его активизации необходим тромбин, который преобразует фибриноген в фибрин-мономер. Фактор свертывания XII трансформирует фибрин-мономер в фибрин-полимер, что позволяет закрепиться кровяному сгустку в зоне повреждения сосудистой стенки. Под воздействием фибринолизина фибрин-полимер расщепляется на мелкие фракции, которые всасываются организмом.

На заметку: недостаточное производство всех указанных компонентов или нарушение их связей может вызвать тромбоз (закупорку сосудов кровяным сгустком) или же кровотечение. Интересно, что плазма крови без соединений фибриногена полностью теряет способность к свертыванию и в медицинской практике называется «сыворотка».

Фибриноген относится к факторам «ревматической пробы», поэтому его концентрация резко повышается при острых воспалительных процессах, разрывах тканевых покровов, некрозах. Также высокий фибриноген может свидетельствовать об онкологических и аутоиммунных процессах, сердечно-сосудистых болезнях, патологическом протекании беременности. Он влияет на скорость оседания эритроцитов, что необходимо учитывать при проведении анализа на СОЭ.

У беременных фибриноген в норме начинает увеличиваться на последнем триместре и достигает пика к моменту родов (6 г/л при норме 4 г/л).

Уменьшение концентрации этого белка может говорить о сердечной недостаточности, заболеваниях крови и печени, развитии послеродовых осложнений.

Анализ на фибриноген используют для выявления способности организма к гемостазу и тромбообразованию. В качестве биоматериала выступает венозная кровь, взятая с утра на голодный желудок.

Исследование концентрации фибриногена (в рамках коагулограммы) назначается в следующих случаях:

  • в семейном анамнезе фиксируются нарушения свертываемости крови и связанные с этим генетические патологии;
  • заболевания сердца и сосудов;
  • острые инфекционные и воспалительные процессы;
  • болезни крови и нарушения системы кровообращения;
  • кровотечения неясной этиологии;
  • заболевания или функциональные расстройства печени;
  • диагностика состояний, обусловленных врожденным или приобретенным дефицитом фибриногена;
  • недавно полученные обширные ожоги или травмы;
  • контроль лечения тромболитиками, коагулянтами и антикоагулянтами;
  • плановое обследование перед хирургическим вмешательством;
  • скрининг-диагностика будущих мам каждый триместр беременности.

Расшифровку результатов анализа на фибриноген проводит врач-гинеколог, гематолог, терапевт, педиатр, хирург, ревматолог, кардиолог, анестезиолог и другие специалисты.

Для начала гемостаза (процесса свертывания) необходимо не менее 0,5 г/л

  • у небеременных пациентов норма 2-4 г/л*
  • у беременных женщин — 6-7 г/л.

*по данным независимой лаборатории Инвитро

Результат может быть недостоверным по следующим причинам:

  • Врожденные патологии, из-за которых не синтезируется достаточное количество фибриногена (гипо- и афибриногенемия);
  • Диеты, посты, голодания, в результате которых развивается мальабсорбция (нарушение всасывания питательных веществ);
  • Переливание крови;
  • Курение (повышает уровень фибриногена);
  • Стресс, психические и физические нагрузки (повышают);
  • Холецистит и сахарный диабет в анамнезе (повышают);
  • Ожирение (повышает).
  • Склонность к тромбообразованию;
  • Воспалительные, инфекционные или онкологические процессы:
    • грипп в тяжелой форме;
    • воспаление легких (пневмония);
    • туберкулез;
    • рак легких;
    • мононуклеоз и др.;
  • Заболевания почек в острой и хронической форме:
    • гломерулонефрит;
    • пиелонефрит;
    • почечная недостаточность и т.д.;
  • Патологии соединительной ткани:
    • склеродермия;
    • коллагенозы;
    • ревматоидный артрит и пр.;
  • Лучевая болезнь (возникает вследствие воздействия на организм ионизирующего излучения);
  • Заболевания брюшной полости (перитонит);
  • Патологии сердца и головного мозга:
    • инсульт;
    • инфаркт миокарда;
    • нарушение кровообращения в мозге;
  • Сосудистые заболевания:
    • атеросклероз;
    • тромбофлебит;
    • венозная недостаточность;
    • варикозное расширение вен;
    • ангиопатия;
  • Амилоидоз (нарушение белкового обмена в организме);
  • Гипотиреоз (недостаточная секреция гормонов щитовидной железы).

Другие причины повышение фибриногена:

  • III триместр беременности, а также при ее осложнении, тяжелых родах;
  • массовые ожоги тела;
  • травмы, сопровождающиеся внутренним или внешним кровотечением;
  • прием гормональных препаратов: эстрогенов, оральных контрацептивов и т.д.
  • Токсикоз и гестоз у беременных;
  • Дисфункция печени, печеночная недостаточность в острой и хронической форме, другие болезни (цирроз, гепатит);
  • ДВС-синдром (нарушение свертывания из-за массового высвобождения тканевого тромбопластина);
  • Полицитемия (доброкачественные образования системы крови);
  • Миелолейкоз (рак стволовых клеток костного мозга);
  • Рак простаты на стадии появления метастаз;
  • Эмболия (закупорка сосудов) околоплодными водами, которая встречается у новорожденных;
  • Стремительные роды и другие осложнения в родах, кесарево сечение;
  • Бактериальный менингит (вызванный менингококком),
  • Афибриногенемия (наследственная патология, которая характеризуется отсутствием фибриногена в плазме), гипофибриногенемия (дефицит фибриногена).

Концентрация фибриногена снижается и в следующих случаях:

  • нехватка в организме аскорбиновой кислоты, витамина В12;
  • интоксикация змеиным ядом, отравление бледной поганкой;
  • прием лекарственных препаратов:
    • гормоны (андрогены);
    • анаболики;
    • тромболитики;
    • антибиотики;
    • стероиды;
    • барбитураты;
    • вальпроевая кислота;
    • антикоагулянты;
    • ферменты (например, L-аспарагиназа);
    • аспирин;
    • препараты железа;
  • состояние после сильной кровопотери;
  • тромболизис (вид фармакологического лечения, в результате которого растворяется тромб).

В норме в 3-м триместре фибриноген повышается – это защищает организм будущей мамы от большой кровопотери, которая обычно случается во время родов.

1-й 2,3 – 5,0 2-й 2,4-5,1 3-й 6,2 – 7,0

На фоне патологического сгущения крови в кровеносных и плацентарных сосудах могут сформироваться тромбы, в результате чего питательные вещества и кислород не будут поступать в достаточном количестве к плоду, что негативно отразится на его физическом и умственном развитии.

Резкое повышение фибриногена при беременности происходит при:

  • онкологических процессах;
  • недостаточности функции щитовидной железы;
  • некрозе тканей;
  • острых воспалительных, вирусных, инфекционных и бактериальных заболеваниях;
  • воспалении легких;
  • приеме гормональных препаратов на основе эстрогена.

И наоборот, если фибриноген снижается, то кровь разжижается, а это может привести к преждевременной отслойке плаценты и кровотечениям.

Уменьшение фибриногена у будущих мам возникает в следующих ситуациях:

  • заболевания печени (гепатит);
  • дефицит витаминов (аскорбиновой кислоты, витамина В12);
  • гестоз (поздний токсикоз).

Подробнее о показателях свертываемости крови

Важно! Все материалы носят справочный характер и ни в коей мере не являются альтернативой очной консультации специалиста.

Этот сайт использует cookie-файлы для идентификации посетителей сайта: Google analytics, Yandex metrika, Google Adsense. Если для вас это неприемлемо, пожалуйста, откройте эту страницу в анонимном режиме.

источник

Материалы публикуются для ознакомления, и не являются предписанием к лечению! Рекомендуем обратиться к врачу-гематологу в вашем лечебном учреждении!

Соавторы: Марковец Наталья Викторовна, врач-гематолог

Фибриноген — самый главный показатель свертываемости крови. Он синтезируется в печени и образуется в результате воздействия тромбина. Нормативное значение уровня фибриногена варьируется в пределах 2-4 грамм на литр крови. У беременных женщин и у новорожденных детей данный показатель несколько изменен. Любое отклонение от нормы свидетельствует о соответствующих патологических состояниях в организме.

Фибриногеном называют специфический белок плазмы крови, который синтезируется в печени. Он входит в группу анализов свертываемости. Этот белок необходим для нормального состояния гемостаза. Превращаясь в нерастворимый фибрин под воздействием тромбина, фибриноген образует некое образование (тромб), которое останавливает кровотечение, закрывая своими нитями поврежденную стенку сосуда.

Интересно! Если в составе плазмы крови фибриноген отсутствует, то она не свертывается. Такая плазма называется сывороткой.

У взрослого человека фибриноген находится на уровне 2-4 г/л. Норма фибриногена в крови у женщин в положении несколько увеличена −2-6 г/л, все зависит от срока беременности. У новорожденных данный показатель варьируется в пределах 1,3-3 г/л.

Узнать более подробно о норме фибриногена по неделям у беременных женщин можно в статье на нашем портале

В медицине фибриноген называют плазменным фактором гемостаза или свертывания, поэтому забор крови производят исключительно из вены. Пациентам назначают сдать кровь на коагулограмму (анализ свертываемости крови) или биохимию (биохимический анализ крови). Что это? Исследование производят в лаборатории. Венозную кровь помещают в специальную пробирку, где есть антикоагулянт. Спустя некоторое время скрининговые тесты гемостазиограммы специалисты лаборатории выдают лечащему врачу или пациенту. Чтобы расшифровать заключение лаборантов необходимо знать, какие компоненты в него входят:

  1. Фибриноген
  2. АЧТВ
  3. Протромбин
  4. Волчаночный антикоагулянт
  5. Тромбиновое время
  6. Тромбоциты
  7. Протромбиновое время
  8. Протромбиновый индекс
  9. ДВС-синдром и др.

Кальций представляет собой один из наиболее важных внеклеточных элементов организма. У данного минерала имеется целый ряд физиологических функций, среди которых проведение нервных сигналов, обеспечение свертываемости крови. Кальций также необходим как строительный материал скелету и мышечной ткани сердца. Поэтому его отклонения от нормы могут свидетельствовать о развитии различных заболеваний.

Еще один способ определения фибриногена в крови — исследование по Клаусу. К разведенной плазме добавляют большое количество тромбина и следят за скоростью образования сгустка. Таким образом исследуют уровень фибриногена в плазме.

Чтобы результат анализов был правдивым, нужно соблюдать определенные правила:

  • не принимать медицинские препараты, влияющие на свертываемость крови;
  • за 6-8 часов до исследования ничего не есть и не пить;
  • исключить физические нагрузки;
  • нормализовать прием пищи.

Если в биохимическом анализе крови или коагулограмме указан повышенный фибриноген, это может свидетельствовать о наличии тех или иных патологических состояниях:

  • острые воспалительные процессы;
  • инфекционные заболевания;
  • рак;
  • полиорганная недостаточность функции внутренних органов;
  • нарушение функции щитовидной железы;
  • заболевания, связанные с некрозом тканей и клеток;
  • хирургическое вмешательство;
  • обезвоживание организма;
  • прием эстрогенсодержащих противозачаточных средств и др.

Факт! Повышенный фибриноген в ряде случаев определяется в крови у пациентов пожилого возраста и у людей с вредными привычками (курение, алкоголь).

Отклонения фибриногена от нормы в положительную сторону можно корректировать, принимая фибринолитики, антикоагулянты, антиагреганты, витаминные препараты с большим содержанием никотиновой кислоты, витамина А, С, Е и др. Пациенты с повышенным уровнем фибриногена должны исключить из повседневного рациона холестериновые продукты и пищу с высоким содержанием жиров животного происхождения. Чтобы понизить фибриноген, врачи рекомендуют принимать в пищу фрукты, овощи, горький шоколад, морепродукты, какао. Народные целители советуют пить сок алоэ, отвар корня пиона и свежий сок каланхоэ.

Анизоцитоз — отклонение размеров форменных элементов крови от нормы. Это симптом, дающий неспецифическую клиническую картину. Но он значим и достоверен как доказательство нарушений в системе гемопоэза и/или иммунитета, поэтому его обнаружение требует комплексного обследования пациента.

Важно! Самостоятельно расшифровывать анализ крови на фибриноген и назначать себе лечение не стоит. Это должен делать специалист лаборатории или лечащий врач.

Пониженный фибриноген зачастую указывает на несбалансированность питания или нехватку витаминов С и В12. Также отклонение от нормы в меньшую сторону может говорить о циррозе печени, ДВС-синдроме, интоксикации ядами, гепатите или токсикозе. Отклонения в отрицательную сторону корректируются приемом специальных медикаментов и употреблением в пищу некоторых продуктов: картофеля, гречка, шпинат, яйца, орехи, бананы и др.

источник

В развитии ряда патологических состояний: ишемия, воспаление и многих заболеваний, таких как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, сахарный диабет, гипертония, нейродегенеративные, онкологические заболевания ведущую роль играет активация генерации свободных радикалов — окислительный стресс. Современные исследования неоспоримо доказывают, что окислительный стресс предшествует развитию вышеуказанных заболеваний, а измерение маркеров окислительного стресса может быть положено в основу методов прогноза развития и прогрессирования заболеваний. Белки организма являются чувствительными мишенями для активных форм кислорода, а белки плазмы крови, которые также вовлекаются в процессы свободно-радикального повреждения, представляют собой еще и удобный объект для клинико-биохимической диагностики состояний, этиопатогенез которых связан с оксидативным стрессом.

Изобретение относится к области медицины, к клинико-биохимической лабораторной диагностике, а именно к способам определения модифицированных белков и предназначается для селективного количественного определения степени окислительной модификации фибриногена в клинических образцах плазмы крови по содержанию карбонильных групп в фибриновом сгустке.

Не существует единого показателя степени окислительной модификации белков. С этой целью можно регистрировать различные химические или физико-химические изменения белковой молекулы в условиях окислительного стресса, которые будут отражать степень ее повреждения активными формами кислорода. Определение карбонильных групп аминокислотных остатков, образующихся при окислении белков, имеет ряд практических преимуществ по сравнению с другими подходами, а их содержание в белке рассматривается как наиболее адекватный и надежный показатель, количественно характеризующий выраженность химических изменений в структуре белка в зависимости от интенсивности окислительных свободно-радикальных процессов. Согласно оценке, основанной на обобщении литературных данных об окислительной модификации белков in vivo, уровень карбонильных продуктов окисления белков (карбонильных групп) при патологических процессах, сопряженных с окислительным стрессом, возрастает в 2-8 раз (Shacter Е. Quantification and significance of protein oxidation in biological samples. Drug Metabolism Reviews. 2000. V. 32. №3-4. P. 307-326).

В работе Shacter E. и соавторов (1994 г.) было показано, что фибриноген «окисляется» значительно быстрее, чем другие белки при окислении цельной плазмы in vitro в системе железо/аскорбиновая кислота. Содержание карбонильных продуктов окисления (количество карбонильных групп на 1 моль белка) в условиях этого эксперимента для фибриногена составило 9.7 моль/моль, а для альбумина, глобулинов и трансферина — 0.5, 0.6 и 0.8 моль/моль, соответственно (Shacter, Е.; Williams, J.A.; Lim, М.; Levine, R.L. Differential susceptibility of plasma proteins to oxidative modification: examination by Western blot immunoassay. Free Radic. Biol. Med. 17:429-437; 1994).

В клинических исследованиях было показано, что окислительная модификация фибриногена у больных ИБС со стенокардией напряжения, часть из которых перенесла инфаркт, в среднем выше на 40% в сравнении с лицами без ИБС. В то же время окислительная модификация других белков плазмы у этих больных была лишь на 13% выше, чем в группе сравнения (Патент РФ №2298189).

Таким образом, при активации свободно-радикальных процессов окислительная модификация фибриногена идет более интенсивно по сравнению с другими белками плазмы крови.

Накопленные к настоящему времени сведения позволяют многим авторам рассматривать окисленный фибриноген не только как перспективный чувствительный маркер, характеризующий степень выраженности окислительного стресса в организме, но и как фактор, обладающий собственным патогенным действием, в частности при сердечно-сосудистых патологиях. Так, известно, что фибриноген относится к белкам острой фазы, его содержание резко возрастает при воспалительном процессе, который в свою очередь тесно связан с окислительным стрессом. Более высокий уровень фибриногена способствует более интенсивной агрегации тромбоцитов и эритроцитов, ведет к возрастанию вязкости крови. Окислительная же модификация фибриногена под действием активных форм кислорода приводит к изменению его многочисленных свойств и функций. Показано, что «окисленный» фибриноген в большей степени чем «нормальный» усиливает продукцию АФК активированными лейкоцитами, усиливает агрегацию тромбоцитов, активирует апоптоз клеток сосудистого эндотелия, оказывает влияние на параметры свертывания и реологические свойства крови, способствует повышению адгезивных свойств сосудистого эндотелия, что в конечном итоге приводит к формированию и росту атеросклеротической бляшки. Окислительная модификация фибриногена вызывает также изменение его основной функции — превращаться в фибрин и образовывать сгусток, то есть окислительный стресс через модификацию фибриногена вызывает изменение процессов тромбообразования (Азизова О.А., Пирязев А.П., Швачко А.Г. /Окислительная модификация фибриногена замедляет его превращение в фибрин под влиянием тромбина.// Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2009; 147(2): 160-163). Таким образом, прослеживается связь окисленного фибриногена с ключевыми звеньями патогенеза ряда сердечно-сосудистых заболеваний и развитием таких грозных осложнений, как инфаркты и инсульты. В этой связи важно отметить, что повышенное содержание фибриногена в плазме крови давно уже рассматривается как общепринятый независимый риск-фактор развития атеросклероза и его осложнений. Вместе с тем даже при нормальных величинах содержания фибриногена значительное повышение степени его окислительной модификации регистрируется у лиц с ИБС или с подострым инфарктом миокарда (Рагино Ю.И., Баум В.А., Полонская Я.В., Воевода М.И., Никитин Ю.П. /Атеросклероз и окислительные процессы. Новые способы оценки окислительной модификации белков. // Бюллетень СО РАМН, 2006, №4 (122): 67-74).

Таким образом, определение окислительной модификации фибриногена является более чувствительным и информативным диагностическим тестом, чем концентрация самого фибриногена в плазме крови. Однако клинические исследования в данном направлении ограничены существующим уровнем развития методов селективного определения окислительно-модифицированного фибриногена в плазме крови, пригодных для использования в клинико-лабораторной практике.

ДНФГ (2,4-динитрофенилгидразин) представляет собой классический реагент для определения карбонильных группы (С=О) альдегидов и кетонов.

Известен способ Levine R.L. и соавторов (R.L. Levine, D. Garland, С.N. Oliver, А. Amici, I. Climent, A. Lenz, B. Ahn, S. Shaltiel, and E.R. Stadtman /Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. // Methods of Enzymology, 1990, 186: 464-478), в котором ДНФГ-реакцию используют для определения карбонильных групп в белках из тканей и клеточных культур. В результате реакции 2,4-динитрофенилгидразина с карбонильными продуктами окисления (карбонильными группами) белков, к последним через ковалентную связь присоединяются производные 2,4-динитрофенилгидразона, имеющие характерный спектр поглощения. Содержание карбонильных групп в белке пропорционально оптической плотности образовавшихся динитрофенилгидразонов, измеряемой, как правило, при длине волны 370 нм. Способ Levine R.L. и соавторов (1990 г.) по настоящее время является базовым для многочисленных модификаций спектрофотометрического метода определения карбонильных продуктов окисления белков по реакции с ДНФГ. Среди этих модификаций следует выделить методы, которые были целенаправленно разработаны для определения карбонильных продуктов окисления белков сыворотки и плазмы, такие, как метод Дубининой Е.Е. и соавторов (1995 г.), метод Азизовой О.А. и соавторов (2007 г.). Оба эти метода дают интегральную характеристику степени окисления всех белков плазмы, то есть их суммарной фракции.

Читайте также:  Ачтв фибриноген антитромбин iii

Известен способ селективного определения окислительной модификации белков плазмы крови, описанный в статье Shacter Е. и соавторов (1994 г.), при котором разделение белков плазмы проводят методом ДСН-гель электрофореза. Способ так же основан на применении ДНФГ-реакции, однако детекцию карбонильных групп в составе индивидуальных белков осуществляют в системе иммуноблоттинга. С этой целью используют антитела, специфические к динитрофенильным группам производных 2,4-динитрофенилгидразона на поверхности белковых молекул. Метод отличается высокой чувствительностью, как минимум в 100 раз превышающей чувствительность классического спектрофотометрического метода. Именно этим методом была показана более высокая окисляемость фибриногена по сравнению с альбумином и другими белками при металл-катализируемом окислении цельной плазмы (Shacter, Е.; Williams, J.A.; Lim, М.; Levine, R.L. Differential susceptibility of plasma proteins to oxidative modification: examination by Western blot immunoassay. Free Radic. Biol. Med. 17:429-437; 1994). Однако способ является сложным, длительным и трудоемким, требует наличия высокоспециализированного оборудования и дорогостоящих реактивов. Кроме того, данный способ, как указывают сами авторы, является, безусловно, полуколичественным. Указанные обстоятельства накладывают существенные ограничения на применение способа в практике клинических лабораторных исследований.

В отечественных исследованиях широкое применение нашел способ определения степени окисления белков в сыворотке крови человека, предложенный Дубининой Е.Е. и соавторами (Дубинина Е.Е., Бурмистров C.O., Ходов Д.А., Портов И.Г. /Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения. // Вопр мед хим 1995; 1: 24-26). При данном способе суммарную фракцию белков получают осаждением трихлоруксусной кислотой (ТХУ), а в качестве растворителя белкового осадка используют 8 М мочевину. Для анализа берут 0,05-0,1 мл сыворотки, добавляют 20% раствор ТХУ до объема 1 мл, затем приливают равный объем (1 мл) 0,01 М ДНФГ, растворенного в 2 М HCl. В контрольную пробу добавляют вместо ДНФГ равный объем 2 М HCl. Таким образом, конечная концентрация ТХУ и в контрольной, и в опытной пробе составляет около 10% (9,5-9,75%). Пробы инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре, затем центрифугируют при 3000 g 15-20 мин. Осадок промывают 3 раза раствором этанол — этилацетат (1:1) для экстракции липидов и избытка ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков. После высушивания к осадку приливают 2,5 мл 8 М мочевины и выдерживают на кипящей водяной бане в течение 5 мин до полного растворения. Оптическую плотность раствора регистрируют на спектрофотометре в области поглощения образовавшихся 2,4-динитрофенилгидразонов — продуктов реакции карбонильных производных окисления белков с 2,4-динитрофенилгидразином (ДНФГ). Степень окисления белков в сыворотке крови выражают в единицах оптической плотности на 1 мл сыворотки или на 1 мг белка.

Данный способ не является селективным, т.е. не позволяет определить степень окислительной модификации индивидуальных белков, в частности фибриногена, в плазме крови. В связи с этим происходит потеря клинически актуальной информации. Кроме того, выражение степени окислительной модификации белков в Ед оптической плотности/мл сыворотки или мг белка представляется крайне неудачным, так как не позволяет сопоставить результаты, полученные в различных исследованиях. Другим существенным недостатком известного способа является то обстоятельство, что белки сыворотки подвергаются действию 10% ТХУ в течение 1 часа при комнатной температуре. Как известно, ТХУ является сильным денатурирующим агентом, поэтому в биохимической практике осаждение белков с помощью ТХУ осуществляют строго на холоду, при 0°С или при отрицательной температуре, по возможности сводя к минимуму время экспозиции. Необратимая денатурация и агрегация белков может препятствовать как протеканию самой реакции с ДНФГ, так и приводить к ухудшению растворимости белка в мочевине (слипание осадка), что является потенциальной причиной отклонений в результатах и источником артефактов.

Известен способ определения окисляемости белков сыворотки и плазмы крови, разработанный Азизовой О.А. и соавторами, при котором окислительная устойчивость белков оценивается по накоплению карбонильных продуктов окисления белков в процессе медь-индуцированного окисления (О.А. Азизова, А.П. Пирязев, С.Н. Москвина / Метод определения окисляемости белков сыворотки и плазмы крови. // Биомедицинская химия. 2007. Т. 53, №1, с. 99-106). Для определения степени окислительной модификации белков в данном способе к 0,2 мл исследуемых образцов плазмы или сыворотки добавляют 1,0 мл 0,0025 М ДНФГ, растворенного в 2,5 М HCl, а в контрольные образцы — 1,0 мл 2,5 М HCl. Все пробы инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте, затем добавляют 1 мл охлажденного 20% раствора ТХУ, выдерживают 10 мин в холодильнике и центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин. Осадок промывают смесью этанол — этилацетат (1:1) для экстракции липидов и 2,4-ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков. Для этого к осадку добавляют 2 мл смеси этанол — этилацетат, центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин. Затем повторяют процедуру. Полученный осадок высушивают для удаления растворителей. Затем осадок растворяют в предварительно нагретых 2,0 мл 10 М раствора мочевины на кипящей водяной бане. Оптическую плотность опытных и контрольных растворов регистрируют на спектрофотометре при 370 нм. Концентрацию карбонильных продуктов рассчитывают по формуле: С (нмоль/мл)=(Abs370 нм·106/ε370 нм)·X, где С — концентрация карбонильных групп в плазме (нмоль/мл), Abs370 нм — оптическая плотность образца при λ=370 нм, ε370нм=22000М -1 см -1 — коэффициент молярной экстинкции при λ=370 нм, X — фактор разбавления. Содержание карбонильных продуктов пересчитывают на 1 мг белка или 1 мл плазмы. Для определения концентрации белка в плазме используют биуретовый метод.

Способ также является неселективным, поэтому не позволяет получить информацию о степени окисленности индивидуальных белков плазмы, таких как фибриноген, однако авторам данного способа удалось избежать недостатков, отмеченных выше для предыдущего способа.

В качестве прототипа заявляемого изобретения избран способ определения окислительной модификации фибриногена, при котором фибриноген изолируют из плазмы крови, используя его специфическое свойство превращаться в нерастворимый фибрин с образованием организованного сгустка, а содержание карбонильных групп в фибриновом сгустке определяют спектрофотометрическим методом по реакции с ДНФГ (Патент РФ №2298189). Способ является селективным, так как позволяет получить информацию о степени окислительной модификации индивидуального белка плазмы крови — фибриногена. Кроме того, как указывают авторы, способ занимает непродолжительное время исследования, его техническое выполнение весьма простое и работа осуществляется одним врачом-лаборантом, для его выполнения требуется только спектрофотометр и необходимые реактивы, способ может использоваться в условиях клинических биохимических лабораторий для оценки степени окисления фибриногена.

Согласно способу-прототипу сначала определяют концентрацию фибриногена: к 1 мл плазмы крови (3,8% цитрата) добавляют 0,5 мл 20 мМ раствора CaCl2, далее пробу инкубируют на водяной при 37°С 10 минут, образовавшийся сгусток высушивают на бумажном фильтре, взвешивают на торсионных весах и пересчитывают его массу на концентрацию фибриногена в плазме в мг/мл с использованием коэффициента перерасчета 0,222 (гравиметрический метод определения содержания фибриногена в плазме, предложенный Рутберг Р.А. в 1961 г.). Затем к сгустку добавляют 0,5 мл 0,9% раствора NaCl и такой же объем 20% раствора ТХУ. Далее определяют окислительную модификацию сгустка по вышеописанному способу Дубининой Е.Е. и соавторов (1995 г.). Результаты выражают в Ед оптической плотности/мг фибриногена/мл плазмы.

К недостаткам способа-прототипа следует отнести недостатки самого метода Дубининой Е.Е. и соавторов (1995 г.), отмеченные выше. Это длительный контакт белка с ТХУ при комнатной температуре и использование некорректных единиц измерения карбонильных продуктов окисления белка. Поэтому технически более близким аналогом заявляемого изобретения в части модификации самого базового метода определения карбонильных групп белков Levine R.L. и соавторов (1990 г.) является способ Азизовой О.А. и соавторов (2007 г.).

Недостатком способа-прототипа является также активация свертывания плазмы хлоридом кальция, который используется в исходном гравиметрическом методе Рутберг Р.А. для получения фибринового сгустка. Освобождение эндогенного тромбина под действием ионов кальция зависит от состояния плазменных и тромбоцитарных факторов системы свертывания крови у данного пациента и многих других факторов, таких как прием лекарственных препаратов, условия подготовки и хранения образцов и т.д. Поэтому в более поздней модификации гравиметрического метода определения содержания фибриногена в плазме для активации свертывания вместо CaCl2 было предложено использовать раствор тромбина (прямая стимуляция превращения фибриногена в фибрин). Добавка экзогенного препарата тромбина с известной активностью обеспечивает стандартные условия получения фибринового сгустка. При этом сам гравиметрический метод определения содержания фибриногена в плазме крови считается устаревшим, в настоящее время не используется.

Однако наиболее существенным недостатком известного способа является то обстоятельство, что фибриновый сгусток плазмы практически не растворяется ни в 8М мочевине, ни в других растворителях, поскольку молекулы фибрин-мономера, образующие основу сгустка, сшиты поперечными ковалентными связями. Образование ковалентных связей происходит под действием фибрин-стабилизирующего фактора крови (фактор XIII). Считается, что растворение сгустка исследуемой плазмы в 30% мочевине в течение 1 ч является признаком тяжелой недостаточности фактора XIII. Сгусток нормальной плазмы при этом не растворяется (Смоляницкий А.Я. / Методы исследования системы гемостаза// с. 170, в кн. «Лабораторные методы исследования в клинике». Справочник под редакцией проф. В.В. Меньшикова, М.: Медицина, 1987).

Очевидно, что полное растворение фибринового сгустка является необходимым этапом и условием для осуществления самой реакции с ДНФГ и для спектрофотометрической регистрации образовавшихся в этой реакции соединений с карбонильными группами белка. Более того, корректное определение карбонильных продуктов окисления в составе нерастворимого полимеризованного фибрина, как представляется, невозможно ни одним из известных способов.

Указанные недостатки устраняются в настоящем изобретении.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка селективного, количественного и надежного способа определения окислительно-модифицированного фибриногена в клинических образцах плазмы крови. В идеале такой способ должен быть достаточно точным и чувствительным и при этом простым в исполнении, не требующим специального оборудования и дорогостоящих реактивов, пригодным для осуществления в условиях обычной клинико-диагностической лаборатории. Также важно, чтобы объем крови, требуемый для анализа, был приемлемым с учетом практических возможностей забора крови на дополнительные исследования у пациентов, в частности, с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Поставленная задача решается тем, что фибриноген плазмы переводят в фибрин, при этом для активации свертывания используют тромбин, плазму инкубируют при 37°C, образовавшийся сгусток трижды промывают 0,9% раствором NaCl и высушивают на фильтровальной бумаге. Промывка и высушивание имеет целью максимально удалить посторонние белки плазмы из сгустка. Полученный из 1 мл плазмы фибриновый сгусток переводят в растворимое состояние путем гидролиза в 1 мл 1 М раствора NaOH при 100°C, реакцию останавливают через 120±1 с добавлением 1 мл 2 М HCl, пробирки охлаждают, в гидролизате определяют концентрацию белка и концентрацию карбонильных групп.

Концентрацию белка определяют по биуретовой реакции, пересчитывают на концентрацию фибриногена в мг/мл по калибровке фибриногеном. Концентрацию карбонильных групп определяют по реакции с 2,4-динитрофенилгидразином. Вначале инкубируют 0,5 мл гидролизата фибринового сгустка с 2 мл 0,01 М раствора ДНФГ в 2 М HCl (опытная проба) и 0,5 мл гидролизата с 2 мл 2 М HCl (холостая проба) при комнатной температуре 60 минут. Затем к холостой и опытной пробе добавляют охлажденный 20% раствор ТХУ в объемном соотношении 8:5 (4 мл ТХУ на 2,5 мл пробы), выдерживают при -20°C не менее 10 минут, центрифугируют, полученный осадок трехкратно промывают раствором этанола и этилацетата (1:1) от избытка не прореагировавшего ДНФГ по схеме: 5, 3, и 2 мл с центрифугированием при 1500 g по 10 мин при каждой отмывке. После удаления последней порции супернатанта осадки высушивают, растворяют в 2,5 мл 8 М мочевины, растворы в мочевине еще раз центрифугируют 10 мин при 1500 g, затем спектрофотометрически измеряют оптическую плотность при 370 нм. Содержание карбонильных групп в фибриногене нмоль/мг, эквивалентное образовавшимся динитрофенилгидразонам в реакции с ДНФГ, рассчитывают, используя принятый для динитрофенилгидразонов коэффициент молярной экстинкции 22000 М -1 см -1 при указанной длине волны.

В соответствии с общепринятой практикой анализ одного клинического образца плазмы крови рекомендуется выполнять в трех параллельных экспериментах, в каждом из которых независимо получают фибриновый сгусток, определяют значение концентрации фибриногена и содержание карбонильных групп.

Таким образом, в отличие от способа-прототипа в заявляемом способе фибриновый сгусток перед анализом переводят в растворимое состояние путем гидролиза в специально подобранных и строго контролируемых условиях, благодаря чему получают гидролизат с требуемыми свойствами, а дальнейшее определение карбонильных групп в реакции с ДНФГ проводят способом, модифицированным с учетом специфических физико-химических свойств полученного гидролизата. При этом для активации свертывания плазмы используют раствор тромбина, а содержание фибриногена (мг/мл) определяют биуретовым методом. Результаты определения окислительной модификации фибриногена представляют в стандартизованном виде, как количество карбонильных групп, содержащихся в 1 мг фибриногена (нмоль/мг), что позволяет сравнивать данные различных исследований, в том числе полученные разными способами.

Преимуществом предложенного способа является аналитическая надежность (воспроизводимость, правильность, чувствительность, специфичность) измерения карбонильных групп в фибриновом сгустке, которая достигается, прежде всего, благодаря полной растворимости анализируемого образца в мочевине, в то время как в прототипе выполнение данного условия не обеспечивается.

Более высокая аналитическая надежность достигается также за счет применения биуретового метода для определения концентрации фибриногена вместо взвешивания фибринового сгустка, использования стандартного раствора тромбина для прямой активации превращения фибриногена в фибрин вместо опосредованной активации раствором CaCl2, а также за счет минимизации денатурирующего действия ТХУ путем сокращения экспозиции и инкубации при -20°C. Добавление охлажденной ТХУ после окончания инкубации образца с ДНФГ, а не в начале, как в прототипе, и последующее охлаждение образца до -20°C призвано еще и остановить реакцию и, следовательно, более точно соблюдать заданное время протекания реакции.

В то же время предложенный способ не требует использования дополнительного по сравнению с прототипом оборудования, редких или дорогостоящих реактивов, также прост в техническом исполнении и может применяться для анализа окислительной модификации фибриногена в условиях общеклинической биохимической лаборатории.

Между тем, процесс температурного щелочного гидролиза характеризуется сильной нелинейностью, а белковый гидролизат по ряду свойств отличается от нативных белков. Поэтому для достижения указанного технического результата необходима оптимизация условий гидролиза, а также существенная модификация самого метода спектрофотометрического определения карбонильных групп белков в ДНФГ-реакции с учетом специфических физико-химических свойств гидролизата фибринового сгустка.

Так, известен унифицированный колориметрический метод определения фибриногена в плазме (утвержден приказом Минздрава СССР от 15.10.1974 №960 «Об унификации клинических лабораторных методов исследования»), при котором фибриноген превращают в фибрин путем добавления тромбина, затем фибриновый сгусток растворяют в щелочи и определяют концентрацию белка по биуретовой реакции. Кратко: в 2 пробирки (для параллельных определений) вводят по 0,2 мл цитратной (3,8% цитрата натрия) или оксалатной (1,34% оксалата натрия) плазмы, добавляют по 0,1 мл раствора тромбина в 0,85% растворе хлорида натрия с активностью 7-10 с и ставят пробирки в водяную баню при 37°С. Через 1 ч сгустки извлекают, трижды отмывают охлажденным 0,85% раствором хлорида натрия и высушивают на фильтровальной бумаге. Каждый из сгустков помещают в пробирку с 1 мл 1 н. раствора NaOH и ставят пробирки на 5 мин в кипящую воду. Пробы охлаждают до комнатной температуры и добавляют в каждую пробирку по 1 мл биуретового реактива. Через 30 мин пробы колориметрируют при длине волны 500-560 нм против дистиллированной воды. Для определения количества фибриногена в мг/мл предварительно строят график соотношения между показаниями ФЭКа и концентрацией фибриногена в растворе. Для этого используют стандартные разведения чистого фибриногена (коагулируемого белка) в пределах от 0,5 до 10 мг/мл (Смоляницкий А.Я. /Методы исследования системы гемостаза// с. 169, в кн. «Лабораторные методы исследования в клинике». Справочник под редакцией проф. В.В. Меньшикова, М.: Медицина, 1987). Унифицированный колориметрический метод сохраняет свое значение по настоящее время в качестве референтного способа определения концентрации фибриногена в плазме крови благодаря высокой точности биуретового метода определения белка.

Исходя из задач настоящего изобретения в представленном примере наиболее важным является то обстоятельство, что белковый гидролизат фибринового сгустка количественно и качественно соответствует фибриногену, содержащемуся в исходном образце плазмы, что указывает на высокую специфичность заявляемого способа, в котором также используется гидролизат фибринового сгустка. В то же время по биуретовой реакции определяется содержание пептидных связей, однако определение содержания карбонильных групп в гидролизате, полученном по вышеописанной методике, с помощью известных способов не представляется возможным из-за малых размеров пептидных фрагментов.

Разделение молекул белка и не прореагировавшего ДНФГ (реакция проводится в условиях 100-1000-кратного избытка ДНФГ) является одним из неотъемлемых этапов определения карбонильных групп. С этой целью обычно проводят осаждение белка трихлоруксусной кислотой (ТХУ), в присутствии которой выпадают в осадок белки и пептиды с молекулярной массой порядка 10 кД и выше. Метод широко используется в биохимической практике как быстрый и удобный способ очистки белков от низкомолекулярных примесей. Также хорошо известно применение этанола различных концентраций и других органических растворителей с целью осаждения или фракционирования белков. Однако ни ТХУ, ни этанол с этилацетатом, используемые в стандартной методике для дальнейшей отмывки белкового осадка от примесей ДНФГ, не осаждают белок гидролизата фибринового сгустка, полученный вышеуказанным способом, поскольку средний размер пептидов оказывается ниже критического.

Читайте также:  Ачтв повышен фибриноген понижен

В специальных экспериментах установлено, что зависимость среднего размера пептидных фрагментов фибринового сгустка от интенсивности щелочного гидролиза имеет резко выраженный экстремальный характер, в связи с чем возникает необходимость в подборе и строгом контроле условий гидролиза. С этой целью в заявляемом способе используется добавка к 1 М раствору NaOH равного объема 2 М HCl, которая в силу двухкратного избытка кислоты позволяет мгновенно остановить реакцию гидролиза. Изучение различных режимов гидролиза (температура; время; концентрация NaOH) с остановкой реакции показало, что при недостаточном гидролизе фибриновый сгусток остается полностью или частично нерастворимым и не растворяется после всех процедур в мочевине, следовательно, такой образец не может быть использован для спектрофотометрического определения карбонильных продуктов. При более интенсивном гидролизе, например таком, который используется в вышеописанном унифицированном колориметрическом методе определения фибриногена (100°С; 5 мин; 1 М NaOH), гидролизат становится слишком «низкомолекулярным», вследствие чего растворяется в ТХУ, а также в спирте и этилацетате, поэтому его нельзя отделить от свободного ДНФГ методом осаждения. Оптимальным результатом гидролиза было бы полное растворение сгустка в щелочи и полное осаждение белкового гидролизата в растворе ТХУ. Однако даже при минимальной продолжительности гидролиза порядка 2 мин, требующейся для полного растворения фибринового сгустка, возникают значительные потери белка при осаждении.

Для осаждения белков обычно используют ТХУ в конечной концентрации 10%, как правило, путем добавления 20% раствора ТХУ в соотношении 1:1 в исследуемой пробе. ТХУ в конечной концентрации 10% используется и в ранее известных способах определения карбонильных групп белков в реакции с ДНФГ. Установлено, что при объеме пробы 2,5 мл увеличение объема добавки 20% ТХУ с 2,5 мл до 4 мл позволяет практически полностью осадить белок из гидролизата, полученного в оптимальных условиях (100°С; 120±1 с). Использование более высоких концентраций ТХУ является нецелесообразным, так как не повышается эффективность осаждения, приводит к необоснованному расходу реактива.

Поэтому в отличие от известных способов в настоящем изобретении используется экспериментально подобранная конечная концентрация ТХУ около 12,3%, которая достигается при смешивании 20% раствора ТХУ с реакционной смесью, содержащей гидролизат фибрина и раствор ДНФГ, в объемном соотношении 8:5.

Дальнейшая отмывка осадка от ДНФГ, который не связался с карбонильными группами белков, согласно базовому способу Levine R.L. и соавторов (1990 г.), а также его модификациям, проводится смесью этанола и этилацетата в соотношении 1:1. Белки, как известно, не растворяются ни в спирте с низким содержанием воды, ни в этилацетате, в раствор переходят только низкомолекулярные соединения. Смесь также эффективно экстрагирует липиды, с которыми может быть связан ДНФГ, не имеющий отношения к карбонильным группам белка, и другие низкомолекулярные хромофоры, препятствующие спектрофотометрии. При этом использование 1-2 мл смеси этанола и этилацетата оказывается достаточным для эффективной отмывки при условии трехкратной смены раствора. Однако в случае отмывки осадка, полученного из гидролизата фибринового сгустка, от 30 до 50% белка переходит в отмывочный раствор, вследствие чего результаты определения карбонильных групп оказываются не только сильно заниженными, но и характеризуются большим разбросом значений.

Данное явление, как оказалось, обусловлено разбавлением этанола и этилацетата небольшим остатком жидкости в пробирке с осадком, вследствие чего относительно короткие пептиды гидролизата приобретают растворимость. Полное удаление супернатанта, оставшегося после осаждения ТХУ, технически затруднительно, однако эффект разбавления этанола и этилацетата можно снизить за счет увеличения объема самой промывочной смеси. Увеличение количества смеси для отмывки с 2 до 5 мл позволяет резко сократить потери белка, при этом повышается прочность связывания осадка со стеклом и, что крайне важно, существенно улучшается сходимость результатов в параллельных измерениях.

Таким образом, в отличие от известных способов определения карбонильных продуктов окисления в белках плазмы и сыворотки в предложенном способе отмывка осадка гидролизатата фибрина от избытка ДНФГ производится ступенчато: для 1-й отмывки используют 5 мл смеси этанола и этилацетата, для 2-й — 3 мл, для 3-й — 2 мл. Предложенная схема позволяет максимально снизить потери белка и является оптимальной по расходу реактивов. При этом суммарные потери белка на этапе осаждения и отмывки составляют около 10% от исходного содержания фибриногена. Аналогичные потери по литературным и собственным данным возникают и при определении карбонильных групп в коммерческом препарате фибриногена или альбумина и рассматриваются как вполне приемлемые для данного метода. Однако указанную систематическую погрешность следует учитывать при анализе результатов.

Модификация процедур осаждения белка и отмывок от низкомолекулярных примесей является важным элементом настоящего изобретения, так как стандартные схемы осаждения и отмывки, применявшиеся ранее, не позволяют получить достоверные результаты при определении карбонильных групп в гидролизате фибринового сгустка, физико-химические свойства которого сильно отличаются от свойств обычных белков.

Следует отметить, что в предложенном способе применяется отмывка от не прореагировавшего ДНФГ без разрушения осадка, поэтому эффективность отмывки зависит от параметров, которые влияют на условия диффузии, таких как конфигурация и размеры пробирок, нагрузки по белку, продолжительность центрифугирования. Рекомендуется использовать определенный тип пробирок, указанный в протоколе.

Одной из особенностей заявляемого способа является центрифугирование растворов белка в мочевине перед измерением оптической плотности. Для спектрофотометрии используют 2 мл супернатанта, который отбирают из общего объема 2,5 мл. Данный этап необходим для удаления волокон фильтровальной бумаги, которые прилипают к фибриновому сгустку в процессе высушивания, а также других частиц нерастворимого материала, вызывающих светорассеяние. В связи с небольшой величиной измеряемого сигнала светорассеяние является одним из основных источников артефактов.

К другим источникам артефактов следует отнести неадекватный контроль, или его отсутствие, недостаточно полную отмывку от ДНФГ, не вступившего в реакцию с карбонильными группами белка, неполное растворение белкового осадка в мочевине.

Для устранения роли случайных отклонений, вероятность которых особенно велика на этапах гидролиза, осаждения и отмывки, анализ одного образца плазмы целесообразно выполнять в трех параллельных экспериментах, в каждом из которых независимо получают фибриновый сгусток, определяют значение концентрации фибриногена и карбонильных продуктов окисления.

Ниже представлены аналитические и рабочие характеристики способа, полученные с использованием пулированной плазмы доноров:

1. Линейность: величина регистрируемого сигнала линейно зависит от концентрации карбонильных продуктов окисления белков при дозовой нагрузке по белку 0,25-1,25 мг.

2. Значение коэффициента вариации: не более 10%.

3. Чувствительность: не менее 0,5 нмоль/мг.

4. Специфичность (по отношению к фибриногену): не менее 95%.

5. Количество плазмы/крови для исследования: 3-4/8-10 мл.

6. Затраты времени на анализ 4-х клинических образцов: 4,5-5 ч.

Правильность результатов исследования уровня окислительной модификации фибриногена, как одна из характеристик аналитической надежности диагностического лабораторного теста, достигается за счет выявления и устранения всех факторов, вызывающих отклонение измеряемого значения от его истинной величины (с учетом статистической погрешности). Для проверки правильности измерений заявленным способом были проведены исследования уровня окислительной модификации фибриногена в образцах, полученных путем смешивания плазмы больных с высоким и низким значением данного показателя. Результаты этих измерений в пределах статистической ошибки совпадают с расчетными значениями, что подтверждает аналитическую правильность способа.

О правильности результатов измерений заявляемым способом свидетельствует и сам по себе линейный характер зависимости содержания карбонильных продуктов от количества фибриногена в указанном выше диапазоне 0,25-1,25 мг.

В этой связи необходимо отметить, что правильность и точность измерений достигается также за счет использования в предлагаемом изобретении определенного соотношения компонентов реакционной смеси: 0,5 мл гидролизата фибринового сгустка и 2 мл 0,01 М раствора ДНФГ в 2 М HCl. Указанное соотношение является оптимальным, так как при обычной концентрации фибриногена в плазме 2,0-4,0 мг/мл, содержание белка в пробе для анализа составляет 0,5 мг — 1 мг, то есть не выходит за границы линейного диапазона измерений.

Если в исследуемом образце плазмы крови содержание фибриногена существенно отклоняется от нормальных значений, то добавка гидролизата, вносимая в реакционную смесь, может быть легко скорректирована: при высоком содержании фибриногена — путем разведения, а при низком — путем увеличения объема. В случае гипо- и афибриногенемии способ не применяется.

Необходимым условием получения достоверных результатов при использовании заявляемого способа является строгое соблюдение всех режимов и условий, указанных в формуле изобретения. С этой целью в клинико-лабораторной практике целесообразно придерживаться единого протокола исследования окислительной модификации фибриногена. Ниже представлен рекомендуемый протокол определения карбонильных продуктов окисления белка в гидролизате фибринового сгустка плазмы крови.

Кровь из локтевой вены забирают по стандартной методике, в качестве антикоагулянта используют цитрат натрия в конечной концентрации 3,8%, центрифугируют в пластиковых пробирках 15 мин при 1000 g. Плазму разливают на аликвоты объемом 3,5-4 мл, хранят при -20°C.

Анализ фибриногена из одного образца плазмы проводят в трех параллельных экспериментах. Плазму размораживают, встряхивают на вортексе, центрифугируют 15 мин при 1500 g для удаления нерастворимого материала. В три пластиковые пробирки разливают по 1 мл исследуемого образца плазмы, добавляют по 0,2 мл p-pa тромбина с активностью 6 IU/мл и помещают на 40-60 мин в термостат при 37°C для образования фибриновых сгустков. Сгустки промывают трехкратно 10 мл физраствора. Для удаления посторонних белков и влаги сгустки высушивают между листами фильтровальной бумаги: полностью высушенный сгусток при сжатии не оставляет влажный отпечаток на бумаге. Для проведения гидролиза и реакции с ДНФГ каждый из сгустков помещают в отдельную стеклянную толстостенную пробирку с круглым дном.

В пробирки с высушенными сгустками добавляют по 1 мл 1 М NaOH, немедленно помещают в кипящую воду, через 120±1 с реакцию останавливают добавлением 1 мл 2 М раствора HCl, пробирки погружают в холодную водопроводную воду (10-15°C) на 3-5 мин.

Гидролизаты фибриновых сгустков тщательно пипетируют, добиваясь однородности (раствор фибрина как правило мутный и может содержать взвесь, однако это не является препятствием для проведения анализа), после чего из каждого образца отбирают по 0,5 мл в 2 круглодонные стеклянные толстостенные пробирки (контрольная и опытная проба) для определения карбонильных групп (реакция с ДНФГ).

Оставшийся гидролизат используют для определения концентрации белка по биуретовой реакции согласно унифицированному колориметрическому методу определения фибриногена, описанному выше (см. например: Смоляницкий А.Я. / Методы исследования системы гемостаза// с. 169, в кн. «Лабораторные методы исследования в клинике». Справочник под редакцией проф. В.В. Меньшикова, М.: Медицина, 1987). С этой целью можно использовать готовые реагенты, например, набор реагентов для определения общего белка в сыворотке и плазме крови «Общий белок-01-витал» фирмы «Витал Диагностике Спб». Для построения калибровочной зависимости используют коммерческий препарат фибриногена с известной степенью очистки (по содержанию коагулируемого белка).

Ход определения карбонильных продуктов окисления. В опытную пробу с гидролизатом сгустка добавляют 2,0 мл 0,01М р-ра ДНФГ в 20% HCl, в контрольную — 2,0 мл 20% HCl без ДНФГ (холостая проба), инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа, добавляют по 4 мл охлажденного 20% раствора ТХУ, выдерживают не менее 10 мин в морозильной камере при -20°С для формирования преципитата, центрифугируют 10 мин при 1500 g. Супернатант осторожно удаляют пипеткой, избегая разрушения осадка. К осадку добавляют 5 мл смеси этананола с этилацетатом, взятых в соотношении 1:1, центрифугируют 10 мин при 1500 g, супернатант сливают. Вторую отмывку проводят 3 мл смеси этананола с этилацетатом, третью — 2 мл в том же режиме центрифугирования. Пробирки с осадком высушивают в перевернутом состоянии при комнатной температуре не менее 20 мин. К осадкам добавляют по 2,5 мл 8 М мочевины. Полное растворение осадка достигается в течение 3 мин на кипящей водяной бане (время засекается по секундомеру). Перед измерением оптической плотности растворы белка в мочевине центрифугируют 10 мин при 1500 g для осаждения мелкодисперсных нерастворимых компонентов, затем отбирают пипеткой по 2 мл в измерительную кювету с длиной оптического пути 1 см.

Оптическую плотность контрольной и опытной пробы измеряют против воды при длине волны 370 нм. Содержание карбонильных групп рассчитывают как количество динитрофенилгидразонов, образовавшихся при связывании карбонильных групп белка с 2,4-динитрофенилгидразином, выраженное в наномолях, на 1 мг белка. Содержание белка в пробе определяют на основании ранее полученного значения концентрации фибриногена в плазме мг/мл биуретовым методом и коэффициента разведения образца, который при использовании объемных соотношений, указанных в протоколе, равен 10. Коэффициент молярной экстинкции динитрофенилгидразонов при 370 нм принимают равным 22000 М -1 см -1 . Для расчета используют рабочую формулу (1):

(1) Скарб=454,55×(А370оп-А370кон)/Сфб, где

Скарб — содержание карбонильных групп в фибриногене (нмоль/мг);

А370оп — оптическая плотность опытной пробы;

А370кон — оптическая плотность контрольной пробы.

Коэффициент 454,55=10×10 6 /22000 включает коэффициент разведения образца, коэффициент молярной экстинкции динитрофенилгидразонов и коэффициент перевода размерности моль/литр в нмоль/мл.

Для каждого исследуемого образца плазмы крови содержания карбонильных групп в гидролизате фибринового сгустка вычисляют как среднее значение по результатам трех измерений.

Оборудование: 1) лабораторная настольная центрифуга с горизонтальным ротором типа ОПН-8, СМ-12 или СМ-6М; 2) вортекс; 3) спектрофотометр; 4) кварцевая кювета с длиной оптического пути 1 см и объемом 4 мл; 5) водяная баня до 100°С; 6) секундомер; 7) термометр для измерения комнатной температуры; 8) пластиковые пробирки на 12-15 мл; 9) круглодонные стеклянные толстостенные пробирки с внутренним диаметром 13,5 мм, высотой 100 мм.

Реактивы и материалы: 1) цитратная плазма замороженная (не мене 3 мл); 2) набор реагентов «Тромбин-реагент» производства НПО «Ренам»; 3) набор реагентов для определения общего белка в сыворотке и плазме крови биуретовым методом «Общий белок-01-витал» фирмы «Витал Диагностикс Спб»; 4) 1М раствор NaOH; 5) 2 М раствор HCl; 6) 20% раствор ТХУ (w/v); 7) смесь этанола с этилацетатом в соотношении 1:1; 8) лиофилизированный человеческий фибриноген фирмы «Sigma» с известной степенью очистки.

С целью апробации заявляемого способа на клинических образцах плазмы крови были проведены исследования уровня окислительной модификации фибриногена у ограниченной группы больных ИБС со стенокардией напряжения II-III функционального класса до прохождения курса лечения (1-я группа, 9 пациентов) и после прохождения 12-недельного курса комбинированной фармакотерапии (2-я группа, 12 пациентов). При этом во вторую группу исследуемых вошло 9 пациентов из первой группы, у которых измерялся уровень окислительной модификации фибриногена до начала лечения. Таким образом, на данном примере клинических исследований имеется возможность оценить изменение степени окислительной модификации фибриногена у пациентов после длительной терапии, направленной на улучшение состояния больных ИБС.

Пример клинического осуществления способа

Больная Н., 63 года, со стабильной ИБС (стенокардия напряжения II-III функционального класса), без сердечной недостаточности, в анамнезе инфаркт миокарда, в течение последних 7 лет умеренная артериальная гипертония. Курс лечения продолжительностью 12 недель включал аспирин, β-блокаторы, статины, антагонисты кальция, ингибиторы АПФ, нитраты. Исходно, а также спустя 12 недель с момента начала терапии был определен уровень окислительно-модифицированного фибриногена в плазме крови. Образцы плазмы хранились в замороженном состоянии при -20°С. Для первого и второго определения использовали по 3 мл плазмы. Выделение и обработку фибриновых сгустков, измерение содержания карбонильных групп осуществляли в трех параллельных экспериментах, в полном соответствии с представленным выше протоколом.

Определяли: С фб — концентрацию фибриногена в плазме в мг/мл, A370 оп — поглощение опытного образца при длине волны 370 нм против H2O, А370 кон — поглощение контрольного образца при длине волны 370 нм против H2O.

С карб — содержание карбонильных групп, выраженное в нмоль/мг белка, рассчитывали по рабочей формуле (1). Уровень окислительно-модифицированного фибриногена в плазме крови представлен как среднее значение и стандартная ошибка среднего.

1. Определение исходного уровня окислительно-модифицированного фибриногена в плазме крови:

Результаты 1-го опыта: С фб = 3,98 мг/мл; А370 оп = 0,067; А370 кон = 0,012;

С карб = 454,6×0,067-0,012)/3,98=6,28 нмоль/мг.

Результаты 2-го опыта: С фб = 3,96 мг/мл; А370 оп = 0,063; А370 кон = 0,012;

С карб = 454,6×(0,063-0,012)/3,96=5,85 нмоль/мг.

Результаты 3-го опыта: С фб = 3,91 мг/мл; А370 оп = 0,06; А370 кон = 0,013;

С карб = 454,6×(0,06-0,013)/3,91=5,46 нмоль/мг.

Таким образом, содержание карбонильных групп в фибриногене (степень его окислительной модификации) составило 5,87±0,236 нмоль/мг, содержание фибриногена в плазме крови — 3,95±0,021 мг/мл.

2. Определение уровня окислительно-модифицированного фибриногена в плазме крови спустя 12 недель с момента начала терапии:

Результаты 1-го опыта: С фб = 3,59 мг/мл; А370 оп = 0,046; А370 кон = 0,01;

С карб = 454,6×(0,046-0,01)/3,59=4,56 нмоль/мг.

Результаты 2-го опыта: С фб = 3,66 мг/мл; А370 оп = 0,044; А370 кон = 0,013;

С карб = 454,6×(0,044-0,013)/3,66=3,85 нмоль/мг.

Результаты 3-го опыта: С фб = 3,61 мг/мл; А370 оп = 0,041; А370 кон = 0,009;

С карб=454,6×(0,041-0,009)/3,61=4,03 нмоль/мг.

Таким образом, содержание карбонильных групп в фибриногене (степень его окислительной модификации) составило 4,14±0,213 нмоль/мг, содержание фибриногена в плазме крови — 3,62±0,025 мг/мл.

Остальные примеры выполнены аналогичным образом. Результаты определения содержания карбонильных групп в гидролизате фибринового сгустка и концентрации фибриногена в плазме крови, как самостоятельного показателя, обобщены в таблице.

Достоверность отличий между группами оценивали по t-критерию Стьюдента. В случае «окисленного» фибриногена значение t-критерия, рассчитанное для двух независимых выборок (n1=9, n2=12; непарный Т-тест), составило 0,09 (p

источник